Types de microscopes à fluorescence

Depuis l'invention du microscope (~1600) et les lentilles courbes de Leeuwenhoek (bactéries, globules, protozoaires, cellules végétales), la question centrale reste : "Que sont ces structures ?" La microscopie à fluorescence y répond en faisant émettre à l'échantillon sa propre lumière quand on l'illumine.

1. Épifluorescence (configuration standard)

Plus courant. Lampe mercure/xénon → filtre excitation (bande étroite) → objectif → échantillon. Les fluorophores (marqueurs moléculaires) absorbent une λ courte, émettent une λ longue. La lumière émise + lumière diffusée retournent par l'objectif → second filtre (barrière) bloque l'excitation → seul le signal fluorescent atteint l'œil/détecteur.

2. Confocal (élimination lumière hors-foyer)

L'épifluorescence collecte toute la lumière du champ (avant, dans, après le plan focal) → image nette + flou de fond. Confocal : Laser focalisé dans le plan focal + sténopé (pinhole) devant détecteur bloquant la lumière hors-foyer. Balayage (scanning) → reconstruction 3D nette, sans flou axial.

3. Multiphoton (excitation non-linéaire, profondeur)

Alignage confocal ultra-sensible. Solution : laser λ deux fois plus grande (moitié énergie). Excitation à 2 photons : fluorophore excité seulement si 2 photons arrivent quasi-simultanément → seulement au foyer laser (spot minuscule). Avantages : Pas de sténopé à aligner, pas de fond parasitaire, pénétration profonde dans tissu diffusant (cerveau, embryon).

4. TIRF - Réflexion Totale Interne Fluorescence (surface uniquement)

Lumière dirigée latéralement dans la lame de verre → onde évanescente pénètre ~100-200 nm dans le milieu (adhérence cellules sur verre). Seule la zone de contact cellule/verre fluoresce. Idéal : récepteurs membranaires, vésicules, dynamique de surface neuronale. Images ultra-propres, zéro fond.

5. Super-résolution (au-delà de la limite de diffraction ~200 nm)

La physique limite le spot focal à ~200 nm (λ/2). Molécules = quelques nm. Techniques "tricheuses" :

• SIM (Illumination Structurée) : motifs d'éclairage → reconstruction computationnelle ~100 nm.
• STED (Émission Stimulée Déplétée) : laser dépletion périphérique → spot effectif < 50 nm.

Les deux sont des méthodes de fluorescence repoussant la limite d'Abbe.

Choix selon besoin : Épifluorescence (routine, rapide), Confocal (3D, coupes optiques), Multiphoton (tissu épais, vivant), TIRF (surface membrane), Super-résolution (nanoscopie, structures < 200 nm).