Types de fluorescence Microscopes

Quand microscopes ont été inventés vers 1600 CE , philosophes naturels ont tourné leurs yeux sur un monde dans un monde . Quand Antoine van Leeuwenhoek conçu petits verres très courbées et un support mécanique pour ajuster la vue , il a ouvert une fenêtre sur le monde microscopique des bactéries, des cellules sanguines , les protozoaires et la structure cellulaire des plantes . Mais tout au long de l'histoire de la microscopie , il a toujours été une question: Quelles sont ces choses étranges vus à travers une lentille ? La microscopie à fluorescence se réfère à un ensemble de techniques qui minimise l'incertitude - car en microscopie de fluorescence lorsque la lumière est brillé sur un échantillon , il brille de sa propre lumière de retour . Épifluorescence
épifluorescence microscopes brillent et recueillent la lumière à travers la même optique . De loin

microscope à fluorescence la plus courante est la configuration à épifluorescence . Dans un microscope à épifluorescence , une source de lumière - typiquement une lampe au mercure ou au xénon - brille à travers un filtre qui sélectionne une région étroite de longueurs d'onde . La lumière filtrée brille sur l'échantillon à travers l' objectif de microscope . La lumière entrante est absorbée par des fluorophores - étiquettes moléculaires qui émettent de la lumière de grande longueur d'onde quand ils absorbent la lumière d'une longueur d'onde plus courte . La lumière provenant des fluorophores , de même que la lumière diffusée à partir de la source d'éclairage , retourne dans la lentille d'objectif et le détecteur ou les yeux. Sur le chemin, un autre filtre bloque la lumière d'éclairage , donc tout ce qui reste est la lumière fluorescente de l'échantillon.
Confocale

Un microscope à épifluorescence recueille la lumière d' partout à l'intérieur du champ de vision du microscope. Une partie de la lumière d'excitation est absorbée avant que le plan focal du microscope , une partie au niveau du plan focal et une partie au-delà du plan focal. Parce que le microscope recueille toute cette lumière , l'image contiendra une image nette de la lumière au foyer , mais il aura également la lumière out-of- focus de d'autres régions . Un microscope confocal qui corrige en focalisant un spot laser dans le même plan que le microscope est focalisé . Ensuite , un trou d'épingle passe devant le détecteur , où il bloque toute la lumière qui ne vient pas de la mise au point du microscope. En balayant l'échantillon , une image propre en trois dimensions de l'objet peut être obtenu.

Multiphoton
Dans un microscope à fluorescence la lumière vient de molécules dans l'échantillon .

Dans un microscope confocal l'alignement est très sensible . Si la tache laser , l'objectif du microscope , l'optique de collecte et le trou sont éteints le moindre montant de la performance du microscope souffre . Un microscope multiphotonique permet de contourner ce problème en utilisant une longueur d'onde de laser qui est à moitié aussi énergique que ce doit être pour exciter les fluorophores de l'échantillon . La seule façon de les fluorophores seront s'énerver et émettre une fluorescence est si la lumière laser est assez lumineux de sorte que deux particules de lumière - les photons - frappent le fluorophore dans un temps très court . Cela se produit uniquement lorsque le laser est focalisé à un très petit point . Donc, le seul endroit dans l'échantillon qui émettent de la lumière là où le laser est focalisé , qui conserve l'image belle et propre , car il n'y a pas de rétro-éclairage supplémentaire pour se débarrasser de - . Qui signifie pas de trou pour aligner
réflexion interne totale
fluorescence ( FRBR)
Un seul échantillon peut avoir plusieurs fluorophores .

autre façon d'obtenir des images très propres est de s'assurer que la lumière d'excitation ne va pas très loin dans l'échantillon . Si une goutte de neurones , par exemple, est placé dans une goutte de solution sur une lame de verre , puis une partie des neurones vont adhérer à la surface du verre. Dans une réflexion interne totale fluorescence ( FRBR) de microscope la lumière est dirigée latéralement dans la lame de verre afin de ne pas vraiment faire dans la solution de fixation des cellules . Mais une partie de la lumière fuit à peine dans la solution - juste tout près de la surface du verre . Cela signifie que les seuls endroits qui émettent de la lumière sera dans une région très mince tout contre la surface du verre . Pour quelque chose comme les neurones , où tant de choses intéressantes qui se produit sur ​​la surface des cellules , cette technique peut être très efficace
Super- Résolution

Tous les microscopes . - y compris des microscopes à fluorescence - sont limitées par la physique qui régissent la propagation de la lumière . Une des règles de base est qu'un point de focalisation de la lumière ne peut obtenir si petit - et pas plus petit . Pour la lumière visible , cette taille est d'environ 200 nanomètres , ou 200 milliardièmes de mètre . Mais molécules uniques sont seulement quelques nanomètres , donc il ya beaucoup de fonctionnalités intéressantes qui sont en dessous de cette limite de taille , appelés la limite de diffraction . Les scientifiques développent des techniques de « super-résolution » de se faufiler autour de cette limite . Microscopie illumination structurée ( SIM ) et stimulé l'épuisement des émissions ( STED ) microscopie , par exemple , sont les deux méthodes de microscopie de fluorescence qui limitent la taille de la tache lumineuse émettant en réduisant la taille de la tache de lumière d'excitation .